Juan Esteban Pedernera nació en San José del Morro, provincia de San Luis, hijo de Juan Esteban de Quiroga y Dominga Pedernera y Calderón.
Fue llevado por su madre a San Luis, donde el 30 de diciembre de 1796, en la Santa Iglesia Matriz, fue bautizado por fray Félix Sosa, de la segunda orden de predicadores.
En 1815 se incorporó al Regimiento de Granaderos a Caballo de José de San Martín, con el que cruzó los Andes y actuó en las batallas de Chacabuco, Cancha Rayada y Maipú. A órdenes de Marcos Balcarce participó en la segunda campaña al sur de Chile, combatiendo en la batalla de Bío Bío.
Hizo también la campaña del Perú, donde cayó en manos de los españoles y fue liberado en el Callao.
Participó también a las órdenes del general Alvarado la desafortunada Campaña de Intermedios, luchando Ica, Mirave, Torata, Moquegua y Zepita.
En la huida tras el fracaso de la campaña, su barco fue tomado por corsarios españoles y fue llevado prisionero a la isla de Chiloé. Escapó algún tiempo después y regresó a la Argentina hacia 1826.
Al mando de un regimiento tomó parte en la guerra del Brasil, pero sólo después de la central batalla de Ituzaingó, por lo que estuvo casi inactivo.
A su regreso, apoyó la revolución de Juan Lavalle contra el gobernador Manuel Dorrego, y fue uno de sus jefes de caballería en la batalla de Navarro, en la que fue ascendido a coronel. Luego se incorporó a la división del general José María Paz en su lucha contra Juan Bautista Bustos, luchando en las batallas de San Roque, La Tablada y Oncativo como jefe de una parte importante de la caballería.
Por orden del general Paz, incorporó a su regimiento — a la fuerza — a los soldados del caudillo federal derrotado, Juan Facundo Quiroga. Comandó una campaña por la sierra cordobesa, en que capturó y ejecutó a varios caudillejos federales, como los demás jefes de la represión de la resistencia federal.
Destinado a la frontera sudeste de Córdoba, en febrero de 1831 fue sorprendido por Ángel Pacheco en Fraile Muerto. Los soldados federales incorporados a su fuerza se pasaron al enemigo al principio de la batalla, y fue completamente derrotado. Tras la captura de Paz, siguió al general Lamadrid en su retirada a Tucumán, donde fueron derrotados en la batalla de La Ciudadela. En sus memorias, Lamadrid culpó a Pedernera de esa derrota, porque una maniobra inesperada suya causó el desbande de sus tropas. Emigró a Bolivia y Perú, donde le reconocieron sus antiguos servicios.
En 1840 regresó hacia La Rioja para luchar contra el gobierno del general Juan Manuel de Rosas, enviado por la comisión argentina de emigrados antirrosistas, para ser el jefe de estado mayor del caudillo local Tomás Brizuela; éste lo ascendió al grado de general. Tras algunos desencuentros con Brizuela, se unió a las fuerzas del general Lavalle. Fue el jefe de la más importante división de caballería en la batalla de Famaillá, en que los unitarios fueron completamente derrotados. Acompañó a Lavalle hasta San Salvador de Jujuy, donde éste fue muerto por una partida federal, y se encargó del mando de las tropas que huían a Bolivia, llevando también el cadáver de Lavalle. En el camino, como el cuerpo comenzara a descomponerse, ordenó descarnarlo para huir con sus huesos hasta Potosí.
Regresó al Perú, incorporándose al ejército de ese país, con el grado de general. Permaneció allí trece años.
En 1855 fue electo senador nacional por San Luis en el Congreso de Paraná. Un año más tarde fue nombrado comandante de la División de Ejército Sur, con sede en San Luis.
En diciembre de 1858, al conocerse el asesinato del general Nazario Benavídez, ocupó con sus tropas la provincia de San Juan y aseguró la intervención federal a esa provincia.
En 1859 fue elegido gobernador de su provincia; se dedicó casi exclusivamente a organizar fuerzas militares para defenderse contra la agresión del Estado de Buenos Aires.
Participó en la batalla de Cepeda, que obligó a Buenos Aires a unirse al resto del país, en octubre de 1859. Formó parte de la comisión que firmó el Pacto de San José de Flores con el gobierno porteño.
Poco después fue elegido para integrar la fórmula presidencial como vice de Santiago Derqui, que derrotó a la unitaria de Mariano Fragueiro y Antonino Taboada el 6 de marzo de 1859.
Asumió la vicepresidencia y debió reemplazar a Derqui en varias oportunidades; especialmente cuando éste se trasladó a Córdoba a dirigir la intervención y a preparar el ejército para el nuevo enfrentamiento con Buenos Aires.
Después de la derrota de Justo José de Urquiza en la batalla de Pavón, en 1861, y tras la defección de Urquiza, Derqui se retiró del país, dejando una carta que fue interpretada como su renuncia.
Pedernera asumió como presidente, con la intención de convencer al ex presidente de enfrentar a los porteños.
Todo fue en vano, y tras la derrota de Cañada de Gómez, declaró caduco el gobierno de la Confederación, dejando abierto el camino de Bartolomé Mitre al poder. Había sido presidente durante 38 días.
Se retiró a la vida privada en San Luis, y falleció en Buenos Aires el 1 de febrero de 1886.
Sus restos están sepultados a los pies del imponente monumento ecuestre inaugurado en 1915, y que honra su figura en la Plaza Pedernera de la localidad de Villa Mercedes, en la Provincia de San Luis.
Carlos Pellegrini dijo después de su muerte:"Su voz ha enmudecido, pero la fama recoge su nombre y lo inscribe en la página inmortal que recuerda el de los padres de la patria. La lápida de su sepulcro es pequeña para contener el nombre de sus campañas y de los hechos de armas donde se distinguió por su valor."